Résumé : En raison de la nature symbiotique des micro-organismes endophytes, cette étude visait à étudier l'activité antibactérienne, antifongique et cytotoxique chez les métabolites secondaires des extraits endophytes foliaires de plantes de l'Amazonie brésilienne et du Cerrado. Dans ce travail de thèse 147 micro-organismes cultivables ont été isolés (130 champignons, 3 bactéries e 14 champignons non-identifiés ou inconnus) à partir de 28 plantes (4 espèces collectées au Brésil et 24 en Guyane Française). Tous les micro-organismes furent identifiés par analyse moléculaire des régions spécifiques de l'ADNr en utilisant des techniques de séquençage génomique. Des champignons endophytes de l’ordre des Xylariales furent ceux de plus importante fréquence d’isolation dans cette étude, représentés par 25 isolats. Des extraits bruts à l’AcOEt furent produits à partir de cultures de chaque micro-organisme isolé. Une proportion relative signifiante (23,1%) des extraits démontra une activité sur Candida albicans ATCC 10213, pendant que 4% furent actifs sur Staphylococcus aureus ATCC 29213. Le potentiel cytotoxique des extraits fut évalué pour des lignées cellulaires humaines KB (carcinome cervical utérin), MDA-MB-435 (mélanome), et MRC-5 (fibroblastes de poumon normal), résultant en proportion signifiante avec activité d’inhibition de la prolifération cellulaire (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectivement).Dix-huit métabolites secondaires furent isolés et identifiés à partir du fractionnement des extraits bruts de huit endophytes. Dix-sept de ces substances furent déjà décrites précédemment dans la littérature: l’acide piliformique (24) et la griséofulvine (25) isolés à partir de Xylaria cubensis SNB-GCI02; La phomopirone (26), la pyrenocine (27), l’alterpérilenol (28) et la novae-zelandine (29), isolés de Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-métilmelleina (31) et la dihidrosporothrioride (32) isolées à partir de Xylaria sp. SNB-GTC2501; La mycoleptodiscine (34) et la mycoleptodiscine B (35) isolées à partir de Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; le mycoepoxidiène (36) et la altiloxina A (37) isolés à partir de Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; L’acremonisol (40), le semicochliodinol (41) et le cochliodinol (42) isolés à partir de Chaetomium globosum SNB-GTC2114; la colletofragarone A2 (43) isolée à partir de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; la flavoglaucine (44) isolée à partir de Eurotium rubrum BBS01. Parmi ces substances, la flavoglaucine (44) isolée à partir de E. rubrum BBS01 démontra une activité comparable au contrôle fluconazol en C. albicans (CIM de 4 µg.mL-1). La substance (44) présenta IC50 >10 µM sur cellules normales MRC-5, ce qui en fait un candidat pour des études ultérieures. Dans ce travail, fut identifié pour la première fois l’activité de la colletofragarone A2 (43) isolée à partir de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201. La substance inédite nommée pyrrocidine C (30) fut isolée à partir de L. infectoria SNB-GTC2402 et identifiée par des analyses spectroscopiques (Casella et al., 2013). La pyrrocidine C (30) fut active en S. aureus ATCC 10213 (CIM de 2 µg.mL-1) et ne fut pas considérées cytotoxique pour les cellules normales MRC-5 (IC50 >10 µM), démontrant une sélectivité dans l’action antimicrobienne. Ces résultats démontrent la grande diversité des endophytes fongiques chez les plantes de l'Amazonie brésilienne et du Cerrado et la grande chimiodiversité associée aux métabolites secondaires de ces micro-organismes. Des champignons endophytes tropicaux, comme ceux présentés dans cette étude, peuvent apparaître comme une nouvelle source de substances antimicrobiennes et cytotoxiques.
Because of the symbiotic nature of endophytes, this survey aims to investigate the probality of discovering antibacterial, antifungal and cytotoxic activities in secondary metabolites of leaf endophytes isolated from plants of Amazon and Cerrado biomes. In this study, 147 cultivable microorganisms were isolated (130 fungi, 3 bacteria and 14 unidentified or unknown microbes) from 28 plant species (4 species collected in Brazil and 24 in French Guyana). All endophytes were identified by molecular analyses of specific rDNA regions, with genomic sequencing techniques. Fungal endophytes belonging to Xylariales order were the most frequently isolated in this study, represented by 25 isolates. Crude AcOEt extracts were produced from cultures of each isolated endophyte. A significant relative proportion (23,1%) of extracts showed activity in Candida albicans ATCC 10213, while 4% were active in Staphylococcus aureus ATCC 29213. The cytotoxic potencial of the extracts was evaluated for human cell lines KB (uterin cervical carcinome), MDA-MB-435 (melanoma) and MRC-5 (normal lung fibroblasts), and a significant proportion of them showed cellular proliferation inhibition (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectively).Eighteen secondary metabolites were isolated by the fractionation of eight endophytic extracts. Seventeen of these substances had already been previously described in the literature: piliformic acid (24) and griseofulvin (25) isolated from Xylaria cubensis SNB-GCI02; phomopiron A (26), pyrenocin A (27), alterperilenol (28) and novae-zelandin A (29) isolated from Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-metilmellein (31) and dihidrosporothriorid (32) isolated from Xylaria sp. SNB-GTC2501; mycoleptodiscin A (34) and mycoleptodiscin B (35) isolated from Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; mycoepoxidien (36) and altiloxin A (37) isolated from Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; acremonisol A (40), semicochliodinol A (41) and cochliodinol (42) isolated from Chaetomium globosum SNB-GTC2114; colletofragaron A2 (43) isolated from Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; flavoglaucin (44) isolated from Eurotium rubrum BBS01. Among these substances, flavoglaucin (44), isolated from E. rubrum BBS01, showed comparable antifungal activity with the positive control fluconazol in C. albicans (MIC of 4 µg.mL-1). Flavoglaucin (44) also showed IC50 >10 µM in normal MRC-5 cells, becoming a good candidate for further studies. In this work, the cytotoxic activity of colletofragaron A2 (43), isolated from Colletotrichum sp. SNB-GTC0201 was described for the first time. The unpublished substance named pyrrocidin C (30) isolated from L. infectoria SNB-GTC2402 was identified by spectroscopic analyses (Casella et al., 2013). The pyrrocidin C (30) was active in S. aureus ATCC 10213 (MIC of 2 µg.mL-1), and was not considered cytotoxic for normal MRC-5 cells (IC50 >10 µM), showing selectivity in antimicrobial activity. These results demonstrate the great endophytic fungal diversity in plants of Amazon and Cerrado biomes, along with the chemodiversity associated to the secondary metabolites of these endophytes. Tropical fungal endophytes, like those seen in this work, may emerge as a new source of antimicrobial and cytotoxic substances.
Devido à natureza simbiótica dos micro-organismos endofíticos, este estudo teve como objetivo investigar a atividade antibacteriana, antifúngica e citotóxica em metabólitos secundários de extratos de fungos endofíticos foliares de plantas do bioma Amazônia e Cerrado. Neste trabalho de tese foram isolados 147 micro-organismos cultiváveis (130 fungos, 3 bactérias e 14 fungos não-identificados ou desconhecidos) a partir de 28 plantas (4 espécies coletadas no Brasil e 24 na Guiana Francesa). Todos os micro-organismos foram identificados por análise molecular de regiões específicas de DNAr, com uso de técnicas de sequenciamento genômico. Fungos endofíticos da ordem Xylariales foram os de maior frequência de isolamento neste estudo, representados por 25 isolados. Extratos brutos em AcOEt foram produzidos a partir de culturas de cada micro-organismo isolado. Uma proporção relativa significante (23,1%) dos extratos demonstrou atividade em Candida albicans ATCC 10213, enquanto 4% foram ativos em Staphylococcus aureus ATCC 29213. O potencial citotóxico dos extratos foi avaliado para as linhagens celulares humanas KB (carcinoma cervical uterino), MDA-MB-435 (melanoma), e MRC-5 (fibroblastos de pulmão normal), resultando em proporção significante com atividade de inibição da proliferação celular (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectivamente). Dezoito metabólitos secundários foram isolados a partir do fracionamento de oito extratos brutos endofíticos. Dezessete destas substâncias já tinham sido descritas anteriormente na literatura: ácido pilifórmico (24) e griseofulvina (25) isoladas de Xylaria cubensis SNB-GCI02; phomopirona A (26), pyrenocina A (27), alterperilenol (28) e novae-zelandina A (29) isoladas de Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-metilmelleina (31) e Dihidrosporothriolida (32) isoladas de Xylaria sp. SNB-GTC2501; mycoleptodiscina A (34) e mycoleptodiscina B (35) isoladas de Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; mycoepoxidieno (36) e altiloxina A (37) isoladas de Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; acremonisol A (40), semicochliodinol A (41) e cochliodinol (42) isoladas de Chaetomium globosum SNB-GTC2114; colletofragarona A2 (43) isolada de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; flavoglaucina (44) isolada de Eurotium rubrum BBS01. Dentre estas substâncias, a flavoglaucina (44) isolada de E. rubrum BBS01, demonstrou atividade comparável ao controle fluconazol em C. albicans (CIM de 4 µg.mL-1). Esta substância (44) apresentou IC50 >10 µM em células normais MRC-5, tornando-se candidata para estudos posteriores. Neste trabalho foi identificado pela primeira vez a atividade citotóxica da colletofragarona A2 (43), isolada de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201. A substância inédita nomeada pyrrocidina C (30) foi isolada a partir de L. infectoria SNB-GTC2402 e identificada através de análises espectroscópicas (Casella et al., 2013). A pyrrocidina C (30) foi ativa em S. aureus ATCC 10213 (CIM de 2 µg.mL-1), e não foi considerada citotóxica para as células normais MRC-5 (IC50 >10 µM), demonstrando seletividade na ação antimicrobiana. Estes resultados demonstram a grande diversidade fúngica endofítica em plantas do bioma Amazônia e Cerrado, e a quimiodiversidade associada aos metabólitos secundários destes micro-organismos. Fungos endofíticos tropicais, como os vistos neste trabalho, podem emergir como uma nova fonte de substâncias antimicrobianas e citotóxicas.

http://www.theses.fr/2014AGUY0836/document

Résumé : Dans le cadre de la promotion de systèmes de culture alternatifs à moindres intrants chimiques, des études sur l'introduction de plantes de service ayant vocation à réduire l'usage des pesticides et engrais azotés mobilisent un effort de recherche considérable. Dans le cadre de la production bananière pour laquelle la nuisibilité causée par les nématodes phytoparasites constitue l'une des principales contraintes, une des principales alternatives à l'utilisation de nématicides chimiques repose sur l'usage raisonné en rotation ou en association culturale de plantes de service à propriétés nématorégulatrices. Parmi les espèces candidates, celles du genre Crota/aria spp. ont largement été étudiées en raison de leur aptitude à contrôler les nématodes phytoparasites. Une méta-analyse révèle cependant que même si de nombreux auteurs s'accordent à reconnaître les propriétés allélopathiques des plantes de cette espèce, ils sont également enclins à reconnaître la forte variabilité d'expression de ces propriétés vis-à-vis du contrôle des nématodes selon les situations expérimentées. L'objectif de ce travail repose sur la compréhension du déterminisme biochimique des exsudats. La stratégie expérimentale mise en oeuvre a consisté à tester en conditions contrôlées le comportement biochimique des exsudats racinaires de deux espèces de crotalaires (C retusa, C spectabilis) et d'une espèce sensible, le bananier dessert (Musa spp.) en fonction i) de conditions biotiques variées -i.e. présence ou non de nématodes (Radopholus similis et Meloidogyne arenariaï, et présence ou non de mycorhizes-, ii) de conditions abiotiques contrastées -i.e. utilisation d'un sol naturel vs. substrat neutre, ajout ou non d'engrais chimique. La méthodologie innovante des «plantes à traire » (Brevet INRA) a été requise pour pouvoir travailler sur les exsudats racinaires des plantes conditionnées plutôt que sur des Iixiviats, comme réalisé dans des expérimentations antérieures.Les résultats obtenus en spectrophométrie visible montrent que la modification des conditions abiotiques affecte de manière importante les profils biochimiques des plantes étudiées. En présence du nématode 1..·1. arenaria les profils biochimiques des deux crotalaires sont également modifiés. Des biotests réalisés à l'aide des exsudats racinaires conditionnés au préalable par les modifications biotiques ont permis de démontrer l'effet nématostatique des crotalaires. Des analyses biochimiques en Ge-MS mettent en évidence de manière plus précise des molécules actives mises en jeu sous différentes modalités biotiques et abiotiques. Ces recherches, de portée générique, permettront de mieux comprendre les conditions de l'environnement qui régulent les profils biochimiques des exsudats racinaires des crotalaires et par extension, seront applicables aux recherches menées sur d'autres plantes de service candidates. Ceci aidera, à terme, à définir les conditions environnementales à réunir, pour orienter de manière optimale les effets allélopathiques dans une perspective de nématorégulation naturelle
As part of the promotion of alternative cropping systems at lower chemical inputs, studies on the introduction of cover crops designed to reduce the use of pesticides and nitrogen fertilizers mobilize a considerable research effort. Under banana production for which the hannfu1ness caused by plant-parasitic-nematodes is one ofthe main constraints, one of the main alternatives to the use ofchemical nematicides is based on the rational use in rotation or intercropping of cover rI crops to proteet crops from plant-parasitic-nematodes, Among the candidate species, the species from the genus of Crota/aria spp. have been widely studied because of their ability to control plant parasitic-nematodes. A meta-analysis reveals that although many authors agree allelopathic properties of these species, they are also likely to recognize the high variability of expression of these properties vis-àvis the control of nematodes according to the situations experieaced.. The objective of this woIk is focnsed on the onderstanding of the biochemical determinism of mot exudates onder environment biotic and abiotic variations. The experimental strategy was 10 test onder controlled conditions the biochemical behavior of mot exudates of two species of crotalarias (C retusa, C. spectabilis) and a susceptible species, the dessert banana crop (Musa spp.) with i) modification ofbiotic conditions -ie presence or absence of nematodes iMeloidogyne arenaria and Radopho/us similis), and presence or absence of mycorrhiza-ii) contrasting abiotic conditions -ie using a natural soil vs. neutral substrate, whether to add fertilizer. The innovative methodology of "milking plants" (patent INRA) was required in order to work on the root exudates of plants packed rather thanleachate, as done in previous experiments. The results obtained show that 'visible spectrophotometry changing abiotic conditions affect significantly the biochemical profiles of the studied plants. In the presence of nematode M. arenaria biochemical profiles of both crotalarias are also changed. Bioassays conducted using mot exudates conditioned in advance by biotic changes have demonstrated the effect of nématostatique crotalarias. Biochemical Ge-MS demonstrate more clearly active molecules that are involved in varions biotic and abiotic conditions. This research, generic scope, to better understand the environmental conditions that regulate biochemical profiles of mot exudates crotalarias and by extension, will apply to research on other plants service candidates. This will ultimately define the environmental conditions to meet, to guide optimal allelopathic effects from the perspective ofnatural nématorégulation

http://www.theses.fr/2012AGUY0561/document